?重組表達(dá)蛋白純化后為什么會發(fā)生沉淀？
重組表達(dá)蛋白純化后發(fā)生沉淀，這種情況一般發(fā)生在鎳離子親和純化蛋白中發(fā)生的最多，純化后的蛋白發(fā)生沉淀主要有這么幾種原因：
第一：在Ni純化的過程中，有一部分鎳離子會脫落，脫落的鎳離子屬于重金屬，會對蛋白的凝集和沉積起到一定的作用；
第二：我們?nèi)藶槿斯ぶ圃斓倪@種溶液環(huán)境，不一定真正符合蛋白本身的“生存”的環(huán)境要求，所以要從離子濃度和pH去考慮，特別是鹽離子濃度；
第三：找準(zhǔn)蛋白質(zhì)的一個(gè)等電點(diǎn)，溶液環(huán)境的ph值不能在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的附近，如果在等電點(diǎn)的附近的時(shí)候，這個(gè)時(shí)候蛋白非常容易沉淀；
第四：蛋白反復(fù)凍溶，過程中生成的一些小冰晶會對這個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)造成一定的傷害，離子和緩沖液狀態(tài)發(fā)生較大變化；
第五：如果長時(shí)間放在4度的情況之下蛋白質(zhì)，容易滋生微生物，微生物的生長的可能造成蛋白的性質(zhì)變化或者降解也容易產(chǎn)生一些聚集沉淀。
是不是沉淀的蛋白就一定完全失去了結(jié)構(gòu)活性呢？這個(gè)是不一定的，我們曾經(jīng)做過這樣一個(gè)案例，一個(gè)紅色熒光蛋白表達(dá)。放在4度放了一周，很多的蛋白都沉淀下來了，但是沉淀物依然是紅色的，這個(gè)案例說明了至少這個(gè)蛋白，蛋白質(zhì)沉淀后只是部分失活或者結(jié)構(gòu)變性。如何避免和解決重組蛋白純化后聚集沉淀呢？
我們提出以下幾個(gè)建議：
1.我們建議如果用鎳柱來純化蛋白的時(shí)候，純化的過程純化之后的溶液當(dāng)中適當(dāng)?shù)募右稽c(diǎn)EDTA，讓它螯合脫落下來的鎳離子，減少重金屬對蛋白的傷害。
2.我們可以加點(diǎn)分散劑，避免蛋白質(zhì)分子接觸碰撞，減少它的聚集，這些分散劑，比如說甘油，聚乙二醇，甘露醇，還有這個(gè)山梨醇之類的。
3.我這個(gè)蛋白的話允許你加入一些輔助性的保護(hù)蛋白的話，那是最好比如說這個(gè)白蛋白。
4.可以加一點(diǎn)個(gè)氨基酸，比如說精氨酸。
5.準(zhǔn)確的算出蛋白質(zhì)的pI等電點(diǎn)，算等電點(diǎn)是要把整個(gè)蛋白包括融合的部分都代入計(jì)算，包括載體上的人和蛋白，所以這樣才能算出一個(gè)準(zhǔn)確的等電點(diǎn)，溶液的環(huán)境的pH值，要避免在等電點(diǎn)附近。
6.一個(gè)蛋白有些蛋白比較嬌貴，有些蛋白比較皮實(shí)，在這過程中的話，我們還要避免蛋白的一些熱損傷。
7.很多的蛋白的話，它獨(dú)立的時(shí)候是很難存在的，它必須有一些輔助的離子或者輔助的一些蛋白，它才能夠一個(gè)很好的維持一個(gè)很好的一個(gè)構(gòu)象，所以必要的時(shí)候添加它的一些輔助的蛋白或者是因子。
8.每個(gè)蛋白的情況都不一樣，也許你在處理其他蛋白的時(shí)候都很好，但是處理這個(gè)蛋白的時(shí)候情況完全不一樣，這就是為什么呢？我們研究的這些蛋白，有時(shí)候沒有一招鮮或者是通用方案；我們曾遇過這樣的一個(gè)案例，某個(gè)寄生蟲體內(nèi)的一個(gè)酶，我們表達(dá)的時(shí)候，它可以得到上清表達(dá)非常好，我們對其中的一個(gè)氨基酸進(jìn)行突變，它立馬從上清表達(dá)狀態(tài)變到包涵體表達(dá)狀態(tài)；從這個(gè)地方我們是否可以通過加減氨基酸為蛋白質(zhì)”改命“（改性）。
素材來源于網(wǎng)絡(luò)。
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第一：在Ni純化的過程中，有一部分鎳離子會脫落，脫落的鎳離子屬于重金屬，會對蛋白的凝集和沉積起到一定的作用；
第二：我們?nèi)藶槿斯ぶ圃斓倪@種溶液環(huán)境，不一定真正符合蛋白本身的“生存”的環(huán)境要求，所以要從離子濃度和pH去考慮，特別是鹽離子濃度；
第三：找準(zhǔn)蛋白質(zhì)的一個(gè)等電點(diǎn)，溶液環(huán)境的ph值不能在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的附近，如果在等電點(diǎn)的附近的時(shí)候，這個(gè)時(shí)候蛋白非常容易沉淀；
第四：蛋白反復(fù)凍溶，過程中生成的一些小冰晶會對這個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)造成一定的傷害，離子和緩沖液狀態(tài)發(fā)生較大變化；
第五：如果長時(shí)間放在4度的情況之下蛋白質(zhì)，容易滋生微生物，微生物的生長的可能造成蛋白的性質(zhì)變化或者降解也容易產(chǎn)生一些聚集沉淀。
是不是沉淀的蛋白就一定完全失去了結(jié)構(gòu)活性呢？這個(gè)是不一定的，我們曾經(jīng)做過這樣一個(gè)案例，一個(gè)紅色熒光蛋白表達(dá)。放在4度放了一周，很多的蛋白都沉淀下來了，但是沉淀物依然是紅色的，這個(gè)案例說明了至少這個(gè)蛋白，蛋白質(zhì)沉淀后只是部分失活或者結(jié)構(gòu)變性。如何避免和解決重組蛋白純化后聚集沉淀呢？
我們提出以下幾個(gè)建議：
1.我們建議如果用鎳柱來純化蛋白的時(shí)候，純化的過程純化之后的溶液當(dāng)中適當(dāng)?shù)募右稽c(diǎn)EDTA，讓它螯合脫落下來的鎳離子，減少重金屬對蛋白的傷害。
2.我們可以加點(diǎn)分散劑，避免蛋白質(zhì)分子接觸碰撞，減少它的聚集，這些分散劑，比如說甘油，聚乙二醇，甘露醇，還有這個(gè)山梨醇之類的。
3.我這個(gè)蛋白的話允許你加入一些輔助性的保護(hù)蛋白的話，那是最好比如說這個(gè)白蛋白。
4.可以加一點(diǎn)個(gè)氨基酸，比如說精氨酸。
5.準(zhǔn)確的算出蛋白質(zhì)的pI等電點(diǎn)，算等電點(diǎn)是要把整個(gè)蛋白包括融合的部分都代入計(jì)算，包括載體上的人和蛋白，所以這樣才能算出一個(gè)準(zhǔn)確的等電點(diǎn)，溶液的環(huán)境的pH值，要避免在等電點(diǎn)附近。
6.一個(gè)蛋白有些蛋白比較嬌貴，有些蛋白比較皮實(shí)，在這過程中的話，我們還要避免蛋白的一些熱損傷。
7.很多的蛋白的話，它獨(dú)立的時(shí)候是很難存在的，它必須有一些輔助的離子或者輔助的一些蛋白，它才能夠一個(gè)很好的維持一個(gè)很好的一個(gè)構(gòu)象，所以必要的時(shí)候添加它的一些輔助的蛋白或者是因子。
8.每個(gè)蛋白的情況都不一樣，也許你在處理其他蛋白的時(shí)候都很好，但是處理這個(gè)蛋白的時(shí)候情況完全不一樣，這就是為什么呢？我們研究的這些蛋白，有時(shí)候沒有一招鮮或者是通用方案；我們曾遇過這樣的一個(gè)案例，某個(gè)寄生蟲體內(nèi)的一個(gè)酶，我們表達(dá)的時(shí)候，它可以得到上清表達(dá)非常好，我們對其中的一個(gè)氨基酸進(jìn)行突變，它立馬從上清表達(dá)狀態(tài)變到包涵體表達(dá)狀態(tài)；從這個(gè)地方我們是否可以通過加減氨基酸為蛋白質(zhì)”改命“（改性）。
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